镍琼脂糖凝胶6FF（Ni-NTA琼脂糖凝胶6FF）

产品简介

Ni-NTA琼脂糖凝胶6FF是用于纯化6×His标签重组蛋白的一种纯化介质，它是由6%交联的Sepharose耦连了一种四齿螯合剂NTA而得.它可用于在非变性或变性条件下纯化任何表达系统表达的6xHis标签重组蛋白。NTA，含有四个螯合区，较一般的三齿螯合剂能更好的结合Ni2+。6×His可与Ni2+螯合，从而使His标签蛋白结合在Ni-NTA纯化介质上，未结合的蛋白被洗涤下去，结合在介质上的蛋白经过一定浓度的咪唑或低PH缓冲液的温和洗脱下来，从而得到高纯度的目的蛋白。

镍NTA琼脂糖凝胶6FF特异性好，流速快，螯合镍更稳定，能耐受更高的还原剂，物理和化学稳定性好，批次重复性好。已经螯合好镍离子，使用更方便，由于颗粒粒度均匀，粒径小，所以分离效果更好，可完全代替进口产品。

产品特征：

适用范围

分离能被金属离子吸附的多肽、蛋白、核苷酸、磷酸化蛋白及带His标签的重组蛋白。

应用实例

一.非变性条件下抽提His标签蛋白

1.样品准备

1)准备细胞，接种，诱导表达。对于实验室用的pET载体表达系列，在细胞OD600=0.5-0.8时，用1mMIPTG诱导1-3小时，

可以获得理想的表达效率。收集细胞，置于-70℃或立即进行步骤2操作。

2)加入1/20细胞生长体积的NTA-0 Buffer(20mM Tris-HCl pH7.9,0.5M NaCl,10%Glycerol)和PMSF。PMSF用无水乙醇配制成100mM储存液，-20℃或4℃保存；PMSF使用的工作浓度为1mM；注意：PMSF见水分解，需要在使用前加入。该步骤冰上操作。

3)将细胞悬浮起来，加入溶菌酶（工作浓度为0.2-0.4mg/ml，若表达的宿主细胞内含pLysS或pLysE，可以不加溶菌酶），混匀，冰上放置30分钟，超声或匀浆破碎细胞。该步骤冰上操作。

4)加入10%TritonX-100,使终浓度为0.05%，充分混匀，冰上放置15分钟。

5)1,2000转/分(20,000xg以上)，4℃离心15分钟以上。取上清，置于冰上备用或-20℃保存。

2.层析

1)将NTA树脂装入合适的层析柱，层析用10倍NTA体积的NTA-0Buffer洗。

2)将样品加至NTA层析柱中，流速在15ml/h左右，收集穿透部分，用于SDS/PAGE分析蛋白质的结合情况。

3)层析用5倍NTA体积的NTA-0Buffer洗，流速控制在30ml/h左右。

4)分别用5倍NTA体积的NTA-20、NTA-40、NTA-60、NTA-80、NTA-100、NTA-200、NTA-1000Buffer洗脱，流速控制在15ml/h左右，收集洗脱液，每管收集一个NTA体积。

5)确定目标蛋白质在洗脱液中的分布情况。最为有效的方式是SDS/PAGE分析。也可以用Bradford蛋白质测定试剂盒，快速确定蛋白质的含量，然后用SDS/PAGE分析蛋白质的分布。

6)目标蛋白质需要进一步纯化需要根据蛋白质的用途确定。

3.溶液配制

NTA-0Buffer:20mM Tris-HCl pH7.9,0.5M NaCl,10% Glycerol,

NTA-20Buffer:20mM Tris-HCl pH7.9,0.5M NaCl,10% Glycerol,20mM Imidazole(咪唑)

NTA-40Buffer:20mM Tris-HCl pH7.9,0.5M NaCl,10% Glycerol,40mM Imidazole(咪唑)

NTA-60Buffer:20mM Tris-HCl pH7.9,0.5M NaCl,10% Glycerol,60mM Imidazole(咪唑)

NTA-80Buffer:20mM Tris-HCl pH7.9,0.5M NaCl,10% Glycerol,80mM Imidazole(咪唑)

NTA-100Buffer:20mM Tris-HCl pH7.9,0.5M NaCl,10% Glycerol,100mM Imidazole(咪唑)

NTA-200Buffer:20mM Tris-HCl pH7.9,0.5M NaCl,10% Glycerol,200mM Imidazole(咪唑)

NTA-1000Buffer:20mM Tris-HCl pH7.9,0.5M NaCl,10% Glycerol,1000mM Imidazole(咪唑)

二.变性条件下从包涵体中纯化His标签蛋白

1.样品准备

1）准备细胞，接种，诱导表达。对于实验室用的pET载体表达系列，在细胞OD600=0.5-0.8时，用1 mMIPTG诱导1-3小时，可以获得理想的表达效率。收集细胞，置于-70℃或立即进行步骤2操作。

2)加入1/20细胞生长体积的GuNTA-0Buffer(20mMTris-HCl pH7.9，0.5 M NaCl，10% Glycerol,6M Guanidium HCl)和PMSF。PMSF用无水乙醇配制成200 mM储存液，-20℃或4℃保存；PMSF使用的工作浓度位1mM；注意：PMSF见水分解，需要在使用前加入。

3)将细胞悬浮起来，冰上超声破碎细胞，降低粘稠度。

4)室温放置30分钟，间或混匀或用磁力搅拌。

5)12,000转/分（20,000xg以上），4℃离心15分钟以上。取上清，置于冰上备用或-20℃保存。

2.层析

1)将NTA树脂装入合适的层析柱，层析用10倍NTA体积的GuNTA-0 Buffer洗。

2)将样品加到NTA层析柱中，流速控制在15 ml/h左右，收集穿透部分，用于SDS/PAGE分析蛋白质的结合情况。

3)层析用5倍NTA体积的GuNTA-0Buffer洗，流速控制在30 ml/h左右。

4)分别用5倍NTA体积GuNTA-20、GuNTA-40，GuNTA-60、GuNTA-100、GuNTA-500洗脱，流速在15 ml/h左右，收集洗

脱液，每管收集一个NTA体积。

5)确定目标蛋白质在洗脱液中的分布情况。最为有效的方式是SDS/PAGE分析。也可以用Bradford 蛋白质测定试剂盒，快速确

定蛋白质的含量，然后用SDS/PAGE分析蛋白质的分布。

6)目标蛋白质需要进一步纯化需要根据蛋白质的用途确定。

7)纯化的目标蛋白质需要复性，复性常用的手段可以参考有关手册确定的原则，根据蛋白质的特性来摸索具体的方案。

3.溶液配制

GuNTA-0Buffer:20mM Tris-HCl pH7.9, 0.5M NaCl, 10% Glycerol,6M Guanidium HCl

GuNTA-20Buffer:20mM Tris-HCl pH7.9, 0.5M NaCl, 10% Glycerol,6M Guanidium HCl,20 mM Imidazole(咪唑)

GuNTA-40Buffer:20mM Tris-HCl pH7.9, 0.5M NaCl, 10% Glycerol,6M Guanidium HCl,40 mM Imidazole(咪唑)

GuNTA-60Buffer:20mM Tris-HCl pH7.9, 0.5M NaCl, 10% Glycerol,6M Guanidium HCl,60 mM Imidazole(咪唑)

GuNTA-100Buffer:20mM Tris-HCl pH7.9, 0.5M NaCl, 10% Glycerol,6M Guanidium HCl,100 mM Imidazole(咪唑)

GuNTA-500Buffer:20mM Tris-HCl pH7.9, 0.5M NaCl, 10% Glycerol,6M Guanidium HCl,500 mM Imidazole(咪唑)

附：NTA树脂的再生

NTA树脂在使用若干次数（3-5次）后，结合效率有所下降，可以用以下方法再生，提高树脂的使用寿命和蛋白质的结合效率。NTA树脂再生前需要从层析柱下端流干所有溶液，估计出NTA的树脂体积，按下列次序将再生试剂加到层析柱里，在等上一再生溶液流干后，再加下一再生溶解。用户需要自行准备25%、50%、75%、100%（v/v）乙醇和去离子水。

NTA再生步骤：

（1）从层析柱下端流干所有溶液，用2倍NTA树脂体积的Stripping Solution I洗。

（2）用2倍体积的去离子水洗。

（3）用3倍体积的Stripping Solution II洗。

（4）用1倍体积的25%乙醇洗。

（5）用1倍体积的50%乙醇洗。

（6）用1倍体积的75%乙醇洗。

（7）用5倍体积的100%乙醇洗。

（8）用1倍体积的75%乙醇洗。

（9）用1倍体积的50%乙醇洗。

（10）用1倍体积的25%乙醇洗。

（11）用1倍体积的去离子水洗。

（12）用5倍体积的Stripping Solution III洗。

（13）用3倍体积的去离子水洗。

（14）如果立即使用，用5倍体积的Ni Charging Solution洗，再用10倍体积的平衡溶液（NTA-0Buffer或GuNTA-0 Buffer）洗。

（15）如果想长期储存，加入1倍体积的20%乙醇，4℃保存，使用前需要执行步骤14。

注：

Stripping Solution I:6M GuHCl, 0.2M acetic acid

Stripping Solution II:2% SDS

Stripping Solution III:100 mM EDTA, pH 8.0

Ni Charging Solution:100 mM NiSO4