植物线粒体DNA提取试剂盒

 一，试剂盒组份

二，保存条件

本试剂盒整体保存于2-8℃一年，DNASE I -20℃保存。使用前，在DNase I中加入600ul（50T）或者1200ul（100T）的DNA酶反应液，分装后-20℃保存三个月，如果超过三个月，活性可能会降低，请自行订购DNASE I。线粒体裂解液使用前常温保存，如有沉淀可37℃水浴溶解，不影响使用。

三，说明

线粒体DNA提取的关键是尽可能的去掉核DNA。本试剂盒利用差速离心得到比较纯净的线粒体，再利用DNA酶消化和裂解缓冲系统等多步骤去掉核DNA，最后得到纯净的线粒体DNA。可用于PCR等对纯度要求较高的实验。

本试剂盒用于从植物叶片中分离出完整而纯化的线粒体。适合于田间采摘或者实验室培养的植物叶片中线粒体DNA的提取制备。

四，操作步骤

准备工作：在DNASE I中加入600ul（50T）或者1100ul（100T）的DNA酶反应液，适当分装后-20℃保存。线粒体裂解液保存于常温，如有沉淀37℃水浴溶解，离心机温度下降到4℃（2-8℃），如无低温离心机，也可以常温离心，并将离心时间为10min的改为5min，但最后所得DNA品质及产量可能会有一定影响。

1. 样本采集前处理：无论田间自然生长还是实验室组织培养，采摘前须避光生长24-48小时，以减少叶片组织中糖类及叶绿体含量。取适量植物细胞裂解液，加入0.5% β-巯基乙醇，10ml 植物细胞裂解液加入50ulβ-巯基乙醇，混匀，形成植物细胞裂解液/β-巯基乙醇溶液，此溶液可2-8度保存一个月。

2. 叶片用蒸馏水清洗2-3次，滤纸吸干，有条件请用液氮研磨叶片1-2克，研磨完后，取800mg左右研磨的叶片粉，加入1.5ml预冷的植物细胞裂解液/β-巯基乙醇溶液，混匀。如果无条件（无液氮），请预冷研钵，取洗过的叶片1000 mg，用剪刀剪为碎块放入玻璃匀浆器或者研钵中。加入1.5ml预冷的植物细胞裂解液/β-巯基乙醇溶液，冰上研磨至看不见明显组织块；

3. 将研磨物放置合适的离心管，4℃，1000× g 离心5 min；

4. 将上清转移到一新的离心管中，在沉淀中加入0.5ml Lysis Buffer/β-巯基乙醇溶液，混匀，再次4℃，1000× g 离心5 min，取上清；合并两次上清，将上清4℃ 1000× g 再次离心5 min。

5．取上清，加入一新的离心管中，4℃， 16,000 × g 离心10 min。离心后的上清含胞浆成分，可从中提取胞浆蛋白。将上清转移到新离心管，线粒体沉淀在管底。

6. 在线粒体沉淀中加入0.5 mL  Wash Buffer重悬线粒体沉淀，4℃，1000× g 离心5 min；

7．取上清，加入一新的离心管中，4℃， 16,000 × g 离心10 min。弃上清，高纯度的线粒体沉淀在管底；

8. 加入100ul DNA酶反应液重悬线粒体，吹打均匀后，再加入10ul DNASE I溶液（见准备工作），混匀，37℃水浴10min。此步为消化线粒体表面吸付的核DNA。4℃， 12,000 × g 离心5 min。尽可能的弃上清，再加入200ul TE 重悬线粒体沉淀，4℃， 12,000 × g 离心5 min，洗去残留的DNA酶。

9.得到的沉淀，用200ul TE缓冲液重悬线粒体沉淀，加入10ul  RNase A。加入200ul线粒体裂解液，轻轻混匀（不可吹打），放置1-2min，再加入150ul蛋白沉淀液，迅速混匀。4℃， 12,000 × g 离心5 min。此步骤可进一步去除核DNA。

10．取上清，加入一新的离心管中（如用于酶切分析，可加入此步：选用等体积的酚氯仿异戊醇25:24:1抽提一次，再用氯仿抽提一次，或者直接用氯仿抽提两次，一般来说，此步可去掉一些微量蛋白及糖类，但会造成线粒体DNA的损失，因而用于PCR时可省，并不影响后续实验），加入0.6倍体积的异丙醇（如无异丙醇，可加入2.5倍体积的乙醇沉淀DNA，如离心管太满可分两管）及5-10ul 核酸核酸助沉剂，混匀，-20℃沉淀半小时左右（此步可省），4℃， 12,000 × g 离心10 min。

11. 弃上清，再加入1ml  70%乙醇清洗，4℃， 12,000 × g 离心5min。重复用70%乙醇洗一次。

12. 弃上清，再次离心1min 吸弃上清，不要碰到管底，开盖凉干约5-105min。

13．加入20-30ul TE缓冲液,轻弹管底，37℃水浴5分钟，线粒体DNA溶解。

14. 进行DNA电泳检测及-20℃保存，进行下步的实验。

四 注意事项：
1. 以离心力g计算正确的离心速度，不同的离心机可据此精确计算离心速度。
2. 进行Western Blot和2D-胶电泳，可直接在第7步的沉淀中加入上样缓冲液裂解线粒体。

3. β-巯基乙醇有毒，请注意通风及防护

一般低温度心机都有离心力显示，如果没有，可以用以下公式简单的换算。

G＝1.11×(10^-5)×R×[rpm]^２
G为离心力，一般以ｇ（重力加速度）的倍数来表示；

 [rpm] ^２即：转速的平方； R为半径，单位为厘米。