植物线粒体DNA提取试剂盒   百浩天生物科技有限公司
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 分子生物学试剂 >> 核酸分离纯化 >> 植物线粒体DNA提取试剂盒
  
货  号:
D0218
名  称:
植物线粒体DNA提取试剂盒
规  格:
50T/100T
价  格:
1380/2560
CAS  #:
 

 

植物线粒体DNA提取试剂盒

 一,试剂盒组份

组份

D0218 (50T)

D0218 (100T)

保存温度

DNase I

12mg

22mg

-20
溶解后分装

β-巯基乙醇

1ml

1ml

常温,通风处保存

植物细胞裂解液

100 mL

200 mL

2-8

线粒体清洗液

25 mL

50 mL

2-8

DNA酶反应液

6ml

12ml

2-8

线粒体裂解液

10ml

20ml

常温放置,如有沉淀可37℃水浴

蛋白沉淀液

7.5ml

15ml

2-8

核酸助沉剂

0.5ml

1ml

2-8

TE缓冲液

25ml

50ml

2-8

二,保存条件

本试剂盒整体保存于2-8一年,DNASE I -20℃保存。使用前,在DNase I中加入600ul50T)或者1200ul100T)的DNA酶反应液,分装后-20保存三个月,如果超过三个月,活性可能会降低,请自行订购DNASE I。线粒体裂解液使用前常温保存,如有沉淀可37水浴溶解,不影响使用。

三,说明

线粒体DNA提取的关键是尽可能的去掉核DNA。本试剂盒利用差速离心得到比较纯净的线粒体,再利用DNA酶消化和裂解缓冲系统等多步骤去掉核DNA,最后得到纯净的线粒体DNA。可用于PCR等对纯度要求较高的实验。

本试剂盒用于从植物叶片中分离出完整而纯化的线粒体。适合于田间采摘或者实验室培养的植物叶片中线粒体DNA提取制备。

四,操作步骤

准备工作:在DNASE I中加入600ul50T)或者1100ul100T)的DNA酶反应液,适当分装后-20保存。线粒体裂解液保存于常温,如有沉淀37℃水浴溶解,离心机温度下降到4℃(2-8℃),如无低温离心机,也可以常温离心,并将离心时间为10min的改为5min,但最后所得DNA品质及产量可能会有一定影响。

1. 样本采集前处理:无论田间自然生长还是实验室组织培养,采摘前须避光生长24-48小时,以减少叶片组织中糖类及叶绿体含量。取适量植物细胞裂解液,加入0.5% β-巯基乙醇,10ml 植物细胞裂解液加入50ulβ-巯基乙醇,混匀,形成植物细胞裂解液/β-巯基乙醇溶液,此溶液可2-8度保存一个月。

2. 叶片用蒸馏水清洗2-3次,滤纸吸干,有条件请用液氮研磨叶片1-2克,研磨完后,取800mg左右研磨的叶片粉,加入1.5ml预冷的植物细胞裂解液/β-巯基乙醇溶液,混匀。如果无条件(无液氮),请预冷研钵,取洗过的叶片1000 mg,用剪刀剪为碎块放入玻璃匀浆器或者研钵中。加入1.5ml预冷的植物细胞裂解液/β-巯基乙醇溶液,冰上研磨至看不见明显组织块;

3. 将研磨物放置合适的离心管,41000× g 离心5 min

4. 将上清转移到一新的离心管中,在沉淀中加入0.5ml Lysis Buffer/β-巯基乙醇溶液,混匀,再次41000× g 离心5 min,取上清;合并两次上清,将上清41000× g 再次离心5 min

5.取上清,加入一新的离心管中,4 16,000 × g 离心10 min。离心后的上清含胞浆成分,可从中提取胞浆蛋白。将上清转移到新离心管,线粒体沉淀在管底。

6. 在线粒体沉淀中加入0.5 mL  Wash Buffer重悬线粒体沉淀,41000× g 离心5 min

7.取上清,加入一新的离心管中,4 16,000 × g 离心10 min。弃上清,高纯度的线粒体沉淀在管底;

8. 加入100ul DNA酶反应液重悬线粒体,吹打均匀后,再加入10ul DNASE I溶液(见准备工作),混匀,37水浴10min。此步为消化线粒体表面吸付的核DNA4 12,000 × g 离心5 min。尽可能的弃上清,再加入200ul TE 重悬线粒体沉淀,4 12,000 × g 离心5 min,洗去残留的DNA酶。

9.得到的沉淀,用200ul TE缓冲液重悬线粒体沉淀,加入10ul  RNase A。加入200ul线粒体裂解液,轻轻混匀(不可吹打),放置1-2min,再加入150ul蛋白沉淀液,迅速混匀。4 12,000 × g 离心5 min。此步骤可进一步去除核DNA

10.取上清,加入一新的离心管中(如用于酶切分析,可加入此步:选用等体积的酚氯仿异戊醇25:24:1抽提一次,再用氯仿抽提一次,或者直接用氯仿抽提两次,一般来说,此步可去掉一些微量蛋白及糖类,但会造成线粒体DNA的损失,因而用于PCR时可省,并不影响后续实验),加入0.6倍体积的异丙醇(如无异丙醇,可加入2.5倍体积的乙醇沉淀DNA,如离心管太满可分两管)及5-10ul 核酸核酸助沉剂,混匀,-20℃沉淀半小时左右(此步可省),4 12,000 × g 离心10 min

11. 弃上清,再加入1ml  70%乙醇清洗,4 12,000 × g 离心5min。重复用70%乙醇洗一次。

12. 弃上清,再次离心1min 吸弃上清,不要碰到管底,开盖凉干约5-105min

13.加入20-30ul TE缓冲液,轻弹管底,37水浴5分钟,线粒体DNA溶解。

14. 进行DNA电泳检测及-20保存,进行下步的实验。

四 注意事项:
1.
以离心力g计算正确的离心速度,不同的离心机可据此精确计算离心速度。
2.
进行Western Blot2D-胶电泳,可直接在第7步的沉淀中加入上样缓冲液裂解线粒体。

3. β-巯基乙醇有毒,请注意通风及防护

 

一般低温度心机都有离心力显示,如果没有,可以用以下公式简单的换算。

G1.11×(10-5)×R×[rpm]
G为离心力,一般以g(重力加速度)的倍数来表示;

 [rpm] 即:转速的平方; R为半径,单位为厘米。

 

 

点击数:4074  修改时间:2015-6-11 【打印此页】 【关闭
 
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