血液线粒体DNA提取试剂盒   百浩天生物科技有限公司
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 生化试剂 >> 血液线粒体DNA提取试剂盒
  
货  号:
D0216
名  称:
血液线粒体DNA提取试剂盒
规  格:
50T/100T
价  格:
1560.00/2980.00
CAS  #:
 
血液线粒体DNA提取试剂盒
 一,试剂盒组份
组份
D0216 (50T)
D0216 (100T)
保存温度
DNase I
12mg
12mg*2
-20℃
溶解后分装
RNase A
0.5ml
0.5ml*2
-20℃保存
经常使用可2-8℃放置
红细胞裂解液(10X)
100ml
100ml*2
2-8℃
细胞裂解液
50 mL
100 mL
2-8℃
线粒体清洗液
25 mL
50 mL
2-8℃
DNA酶反应液
6ml
12ml
2-8℃
线粒体裂解液
10ml
20ml
常温放置,如有沉淀可37℃水浴
蛋白沉淀液
7.5ml
15ml
2-8℃
核酸助沉剂
0.5ml
1ml
2-8℃
TE缓冲液
25ml
50ml
2-8℃
二,保存条件
本试剂盒整体保存于2-8℃一年,DNASE I和RNase A  -20℃保存。使用前,在DNASE I中加入600ul的DNA酶反应液,溶解分装后-20℃保存三个月,溶解后的DNASE I如果超过三个月,活性可能会降低,请自行订购DNASE I。线粒体裂解液使用前常温保存,如有沉淀可37℃水浴溶解,不影响使用。
三,说明
本试剂盒可用于从血液中分离完整而纯化的线粒体DNA
线粒体DNA提取的关键是尽可能的去掉核DNA。本试剂盒利用差速离心得到比较纯净的线粒体,再利用DNA酶消化和裂解缓冲系统等多步骤去掉核DNA,最后得到纯净的线粒体DNA。可用于PCR等对纯度要求较高的实验。
四,操作步骤
准备工作:在12mg DNASE I中加入600ul的DNA酶反应液,适当分装后-20℃保存。红细胞裂解液(10X)用双蒸水稀释10倍成工作液(如标本为有核红细胞血液,此试剂用不上,需自备生理盐水或者PBS)。线粒体裂解液保存于常温,如有沉淀37℃水浴溶解。离心机温度下降到4℃(2-8℃),如无低温离心机,也可以常温离心,并将所有离心时间为10min的改为5min,但最后所得DNA品质及产量会有一定影响。
1. 血液处理:
血液要求:非肝素钠抗凝血,最好使用新鲜血液。对于陈旧血液,由于冻凝过程中冰晶已经对细胞核膜和线粒体膜产生损伤,所以线粒体DNA得率会大大减少。
a. 对于无核红细胞全血(如哺乳动物外周血),取血约3-5ml(适当分成几管),加入3倍体积的红细胞裂解液(稀释后的工作液,下同),混匀,800 × g  5 min离心收集白细胞。加入1-2ml红细胞裂解液(稀释后的工作液),吹打重悬白细胞,合并于一管中,800 × g 5~10 min离心收集白细胞。此时如果白细胞有可见红色,可再次用少量(0.5ml)红细胞裂解液洗细一次。
b. 对于有核红细胞全血(如禽类全血),取约300-500ul全血,800 × g 5~10 min离心收集全细胞,用生理盐水或者PBS清洗两次,留沉淀去上清。清洗时请用去尖吸头吹打。
2. 在收集到的细胞中,加入1.0 mL冰预冷的细胞裂解液重悬细胞,将细胞悬液转移到小容量玻璃匀浆器内,0℃冰浴研磨20~40次;
3. 匀浆物转移到离心管,4℃,1000× g 离心5 min;
4. 取上清,加入一新的离心管中,4℃,1000× g 再次离心5 min(一共两次离心,完整去核)。
5.取上清,加入一新的离心管中,4℃, 12,000 × g 离心10 min。离心后的上清含胞浆成分,可从中提取胞浆蛋白。将上清转移到新离心管,线粒体沉淀在管底;
6. 在线粒体沉淀中加入0.5 mL 线粒体清洗液重悬线粒体沉淀,4℃,1000× g 离心5 min;
7.取上清,加入一新的离心管中,4℃, 12,000 × g 离心10 min。弃上清,高纯度的线粒体沉淀在管底;
8. 加入100ul DNA酶反应液重悬线粒体,吹打均匀后,再加入10ul DNASE I溶液(见准备工作),混匀,37℃水浴10min。此步为消化线粒体表面吸付的核DNA。4℃, 12,000 × g 离心5 min。尽可能的弃上清,再加入200ul TE 重悬线粒体沉淀,4℃, 12,000 × g 离心5 min,洗去残留的DNA酶。
9.得到的沉淀,用200ul TE缓冲液重悬线粒体沉淀,加入10ul  RNase A。加入200ul线粒体裂解液,轻轻混匀(不可吹打),放置1-2min,再加入150ul蛋白沉淀液,迅速混匀。4℃, 12,000 × g 离心5 min。此步骤可进一步去除核DNA。
10.取上清,加入一新的离心管中(如用于酶切分析,可加入此步:选用等体积的酚氯仿异戊醇25:24:1抽提一次,再用氯仿抽提一次,或者直接用氯仿抽提两次,一般来说,此步可去掉一些微量蛋白及糖类,但会造成线粒体DNA的损失,因而用于PCR时可省,并不影响后续实验),加入0.6倍体积的异丙醇(如无异丙醇,可加入2.5倍体积的乙醇沉淀DNA,如离心管太满可分两管)及5-10ul 核酸核酸助沉剂,混匀,-20℃沉淀半小时左右(此步可省),4℃, 12,000 × g 离心10 min。
11. 弃上清,再加入1ml  70%乙醇清洗,4℃, 12,000 × g 离心5min。重复用70%乙醇洗一次。
12. 弃上清,再次离心1min 吸弃上清,不要碰到管底,开盖凉干约5-10min。
13.加入10-20ul TE缓冲液,轻弹管底,37℃水浴5分钟,线粒体DNA溶解。
14. 进行DNA检测及-20℃保存,进行下步的实验。
以上方法可以比较完整的去掉核DNA(达到PCR无法检测的级别)但过程复杂,线粒体DNA丢失较多,以下为简单方法,也可以比较好的提到线粒体DNA,在裂解时间合适的情况下,也能去核DNA(达到电泳检测不到的级别)。
1.血液常规处理(红细胞裂解或者全血清洗)
2.200ul TE缓冲液重悬全细胞,加入10ul  RNase A,加入200ul线粒体裂解液,轻轻混匀(不可吹打),放置2-3min,再加入150ul蛋白沉淀液,迅速混匀。4℃, 12,000 × g 离心5 min。
3.取上清,接上面第10步,氯仿抽提,乙醇沉淀。
四 注意事项:
1. 为保证获得完整及尽可能多的线粒体,匀浆条件要示:第一是全程低温操作。第二是快速。第三,如有条件可将匀浆后的碎片在显微镜下观察。
2.线粒体DNA本身含量很低,如果电泳检测不到,可加大上样量,用更少量的TE溶解沉淀,或者直接进入PCR检测。
2. 以离心力g计算正确的离心速度,不同的离心机可据此精确计算离心速度。

一般低温离心机都有离心力显示,如果没有,可以用以下公式简单的换算。
转速与离心力换算
G1.11×(10-5)×R×[rpm]
G为离心力,一般以g(重力加速度)的倍数来表示;
 [rpm] 即:转速的平方; R为半径,单位为厘米。
点击数:429  修改时间:2024/2/19 【打印此页】 【关闭
 
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