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CAS　　#：

 一，试剂盒组份

组份	P0047(50T)	P0047 (100T)
蜗牛酶	600mg	1.2g
山梨醇缓冲液	30ml	60ml
原生质体裂解液	100 mL	200 mL
β-巯基乙醇	1.0ml	1.0ml
线粒体清洗液	25 mL	50 mL
线粒体保存液	5 mL	10 mL

本试剂盒三个月内使用可4℃储存，长期可置-20℃。

本试剂盒可用于从酵母中分离出完整而纯化的线粒体。其制备物，可以被用于细胞凋亡、信号传递、代谢和蛋白组学等的研究。一般不用于进一步DNA提取。

1．取新鲜培养的1-5ml酵母培养物(不超过5×107细胞，湿重50mg或者50ul体积)离心后的收集物（4℃，1000× g 离心5 min）。双蒸水洗一到两次。离心，尽量弃上清。取50ul山梨醇缓冲液洗一次，离心，弃上清。

2．酵母沉淀用0.5ml山梨醇缓冲液重悬，加入10mg蜗牛酶，再加入5ul β-巯基乙醇，混匀（如果一次提取样本较多，可按照比例，每0.5ml山梨醇缓冲液，加入10mg蜗牛酶，再加入5ul β-巯基乙醇混匀，混匀后每管样本加入0.5ml重悬酵母，现配现用），30℃水浴1-2小时。4℃，1000× g 离心5 min，弃上清，得到原生质体。将得到的原生质体用0.5 ml原生质体裂解液重悬，再次离心，弃上清，得到原生质体。

3．将得到的原生质体用0.5 ml原生质体裂解液重悬，并转移到小容量玻璃匀浆器内，0℃冰浴研磨10~20次；

4．将研磨物放置合适的离心管，4℃，1000× g 离心5 min；

5．取上清，加入一新的离心管中，4℃， 16,000 × g 离心10 min。离心后的上清含胞浆成分，可从中提取胞浆蛋白。将上清转移到新离心管，线粒体沉淀在管底。

6. 在线粒体沉淀中加入0.5 mL 线粒体清洗液重悬线粒体沉淀，4℃，1000× g 离心5 min；

7．取上清，加入一新的离心管中，4℃， 16,000 × g 离心10 min。弃上清，高纯度的线粒体沉淀在管底；

8. 用50 -100μL线粒体保存液或合适的反应缓冲液重悬线粒体沉淀，立即使用或-70℃保存。

1. 以离心力g计算正确的离心速度，不同的离心机可据此精确计算离心速度。

2. 进行Western Blot和2D-胶电泳，可直接在第7步后的沉淀中加入上样缓冲液裂解线粒体。

3. β-巯基乙醇有毒，请注意通风及防护。

 

一般低温度心机都有离心力显示，如果没有，可以用以下公式简单的换算。

转速与离心力换算

G＝1.11×(10-5)×R×[rpm]２
G为离心力，一般以ｇ（重力加速度）的倍数来表示；

 [rpm] ２即：转速的平方； R为半径，单位为厘米。