血液线粒体提取试剂盒
一，试剂盒组份
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组份 |
P0046 (50T) |
P0046 (100T) |
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红细胞裂解液（10X） |
100ml |
100ml*2 |
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白细胞裂解液 |
50 mL |
100 mL |
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线粒体清洗液 |
25 mL |
50 mL |
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线粒体保存液 |
5 mL |
10 mL |
二，保存条件
本试剂盒三个月内使用可4℃储存，长期可置-20℃。
三，说明
本试剂盒可用于从血液中分离完整而纯化的线粒体。
其制备物，可以被用于细胞凋亡、信号传递、代谢和蛋白组学等的研究。但不适用于进一步DNA提取。
四，操作步骤
1. 血液处理：
血液要求：非肝素钠抗凝血，最好使用新鲜血液。对于陈旧血液，由于冻凝过程中冰晶已经对细胞核膜和线粒体膜产生损伤，所以线粒体得率会大大减少，并且完整性也会降低。
a. 对于无核红细胞全血（如哺乳动物处周血），取血约5ml（适当分成几管），加入3倍体积的红细胞裂解液（稀释后的工作液,下同），混匀，800 × g 5 min离心收集白细胞。加入1-2ml红细胞裂解液（稀释后的工作液），吹打重悬白细胞，合并于一管中，800 × g 5~10 min离心收集白细胞。此时如果白细胞有可见红色，可再次用少量(0.5ml)红细胞裂解液洗细一次。
b. 对于有核红细胞全血（如禽类全血），取约200-300ul全血，800 × g 5~10 min离心收集全细胞，用生理盐水或者PBS清洗两次，留沉淀去上清。清洗时请用去尖吸头吹打。
2. 在收集到的细胞中，加入1.0 mL冰预冷的白细胞裂解液重悬细胞，将细胞悬液转移到小容量玻璃匀浆器内，0℃冰浴研磨20~40次；
3. 匀浆物转移到离心管，4℃，1000× g 离心5 min；
4. 取上清，加入一新的离心管中，4℃，1000× g 再次离心5 min（一共两次离心，完整去核）。
5．取上清，加入一新的离心管中，4℃， 12,000 × g 离心10 min。离心后的上清含胞浆成分，可从中提取胞浆蛋白。将上清转移到新离心管，线粒体沉淀在管底；
6. 在线粒体沉淀中加入0.5 mL 线粒体清洗液重悬线粒体沉淀，4℃，1000× g 离心5 min(再次去核）；
7．取上清，加入一新的离心管中，4℃， 12,000 × g 离心10 min。弃上清，高纯度的线粒体沉淀在管底；
8. 用50 -100μL线粒体保存液或合适的反应缓冲液重悬线粒体沉淀，立即使用或-70℃保存。
四 注意事项：
为保证获得完整及尽可能多的线粒体，匀浆条件要示：第一是全程低温操作。第二是快速。第三，如有条件可将匀浆后的碎片在显微镜下观察。
一般低温度心机都有离心力显示，如果没有，可以用以下公式简单的换算。
G＝1.11×(10-5)×R×[rpm]２
G为离心力，一般以ｇ（重力加速度）的倍数来表示； [rpm] ２即：转速的平方； R为半径，单位为厘米。 |
