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CAS　　#：

 

 一，试剂盒组份

组份	D0217 (50T)	D0217(100T)	保存温度
DNase I	12mg	22mg	-20℃ 溶解后分装
RNase A	0.5ml	1ml	-20℃保存 经常使用可2-8℃放置
蜗牛酶	500mg	1g	-20℃
β-巯基乙醇	1.0ml	1.0ml	RT
山梨醇缓冲液	30ml	60ml	2-8℃
原生质体裂解液	100 mL	200 mL	2-8℃
线粒体清洗液	25 mL	50 mL	2-8℃
DNA酶反应液	6ml	12ml	2-8℃
线粒体裂解液	10ml	20ml	常温放置，如有沉淀可37℃水浴
蛋白沉淀液	7.5ml	15ml	2-8℃
核酸助沉剂	0.5ml	1ml	2-8℃
TE缓冲液	25ml	50ml	2-8℃

本试剂盒整体保存于2-8℃一年，DNASE I、RNase A和 蜗牛酶  -20℃保存。使用前，在DNASE I中加入600ul（50T）或者1100ul（100T）的DNA酶反应液，分装后-20℃保存三个月，如果超过三个月，活性可能会降低，请自行订购DNASE I。线粒体裂解液使用前常温保存，如有沉淀可37℃水浴溶解，不影响使用。

线粒体DNA提取的关键是尽可能的去掉核DNA。本试剂盒利用差速离心得到比较纯净的线粒体，再利用DNA酶消化和裂解缓冲系统等多步骤去掉核DNA，最后得到纯净的线粒体DNA。可用于PCR等对纯度要求较高的实验。

本试剂盒用于从酵母中分离出完整而纯化的线粒体DNA。

准备工作：在DNASE I中加入600ul（50T）或者1100ul（100T）的DNA酶反应液，适当分装后-20℃保存。线粒体裂解液保存于常温，如有沉淀37℃水浴溶解，离心机温度下降到4℃（2-8℃），如无低温离心机，也可以常温离心，并将离心时间减半，但最后所得DNA品质及产量可能会有一定影响。

 

1．取新鲜培养的1-5ml酵母培养物(约5×107细胞，湿重50mg或者50ul体积)离心后的收集物（4℃，1000× g 离心5 min）。双蒸水洗一到两次。离心，尽量弃上清。取50ul山梨醇缓冲液洗一次，离心，弃上清。

2．酵母沉淀用0.5ml山梨醇缓冲液重悬，加入10mg蜗牛酶，再加入5ul β-巯基乙醇，混匀（如果一次提取样本较多，可取0.5ml山梨醇缓冲液重悬，加入10mg蜗牛酶，再加入5ul β-巯基乙醇预混匀，混匀后每管样本加入0.5ml重悬酵母），30℃水浴1-2小时。4℃，1000× g 离心5 min，弃上清，得到原生质体。将得到的原生质体用0.5 ml原生质体裂解液重悬，再次离心，弃上清，得到原生质体。

3．将得到的原生质体用0.5 ml原生质体裂解液重悬，并转移到小容量玻璃匀浆器内，0℃冰浴研磨10~20次；

4．将研磨物放置合适的离心管，4℃，1000× g 离心5 min；

5．取上清，加入一新的离心管中，4℃， 16,000 × g 离心10 min。离心后的上清含胞浆成分，可从中提取胞浆蛋白。将上清转移到新离心管，线粒体沉淀在管底。

6. 在线粒体沉淀中加入0.5 mL 线粒体清洗液重悬线粒体沉淀，4℃，1000× g 离心5 min；取上清，加入一新的离心管中，4℃， 16,000 × g 离心10 min。弃上清，高纯度的线粒体沉淀在管底；

7. 加入100ul DNA酶反应液重悬线粒体，吹打均匀后，再加入10ul DNASE I溶液（见准备工作），混匀，37℃水浴10min。此步为消化线粒体表面吸付的核DNA。4℃， 16,000 × g 离心5 min。尽可能的弃上清，再加入200ul TE 重悬线粒体沉淀，4℃， 16,000 × g 离心5 min，洗去残留的DNA酶。

8.得到的沉淀，用200ul TE缓冲液重悬线粒体沉淀，加入10ul  RNase A。加入200ul线粒体裂解液，轻轻混匀（不可吹打），放置1-2min，再加入150ul蛋白沉淀液，迅速混匀。4℃， 16,000 × g 离心5 min。此步骤可进一步去除核DNA。

9．取上清，加入一新的离心管中（如用于酶切分析，可加入此步：选用等体积的酚氯仿异戊醇25:24:1抽提一次，再用氯仿抽提一次，或者直接用氯仿抽提两次，一般来说，此步可去掉一些微量蛋白及糖类，但会造成线粒体DNA的损失，因而用于PCR时可省，并不影响后续实验），加入0.6倍体积的异丙醇（如无异丙醇，可加入2.5倍体积的乙醇沉淀DNA，如离心管太满可分两管）及5-10ul 核酸核酸助沉剂，混匀，-20℃沉淀半小时左右（此步可省），4℃， 16,000 × g 离心10 min。

10. 弃上清，再加入1ml  70%乙醇清洗，4℃， 16,000 × g离心5min。重复用70%乙醇洗一次。

11. 弃上清，再次离心1min 吸弃上清，不要碰到管底，开盖凉干约5-10min。

12．加入20-30ul TE缓冲液,轻弹管底，37℃水浴5分钟，线粒体DNA溶解。

13. 进行DNA电泳检测及-20℃保存，进行下步的实验。

四 注意事项：
1. 为保证获得完整及尽可能多的线粒体，匀浆条件要示：第一是全程低温操作。第二是快速。第三，如有条件可将匀浆后的碎片在显微镜下观察。

2．如进行Western Blot和2D-胶电泳，可直接在第6步的沉淀中加入上样缓冲液裂解线粒体。

3．线粒体DNA本身含量很低，如果电泳检测不到，可加大上样量，用更少量的TE溶解沉淀，或者直接进入PCR检测。
4. 以离心力g计算正确的离心速度，不同的离心机可据此精确计算离心速度。

 

一般低温度心机都有离心力显示，如果没有，可以用以下公式简单的换算。

转速与离心力换算

G＝1.11×(10^-5)×R×[rpm]^２
G为离心力，一般以ｇ（重力加速度）的倍数来表示；

 [rpm] ^２即：转速的平方； R为半径，单位为厘米。