酵母线粒体DNA提取试剂盒   百浩天生物科技有限公司
首 页 关于我们 产品中心 产品展示 行业新闻 技术资料 淘宝店铺 产品订购 联系我们
登陆1
用  户:
密  码:
  
生化试剂
分子生物学试剂
蛋白质研究
免疫学相关产品
细胞相关产品
其他自产试剂
实验耗材
仪器
实验服务
 
您是如何知道我们公司的?
网上查询
学长介绍
销售员介绍
其他

  
会员中心 留言簿 联系方式
 
 分子生物学试剂 >> 核酸分离纯化 >> 酵母线粒体DNA提取试剂盒
  
货  号:
D0217
名  称:
酵母线粒体DNA提取试剂盒
规  格:
50T/100T
价  格:
1980/3720
CAS  #:
 
酵母线粒体DNA提取试剂盒
 一,试剂盒组份
组份
D0217 (50T)
D0217(100T)
保存温度
DNase I
12mg
22mg
-20℃
溶解后分装
RNase A
0.5ml
1ml
-20℃保存
经常使用可2-8℃放置
蜗牛酶
500mg
1g
-20℃
β-巯基乙醇
1.0ml
1.0ml
RT
山梨醇缓冲液
30ml
60ml
2-8℃
原生质体裂解液
100 mL
200 mL
2-8℃
线粒体清洗液
25 mL
50 mL
2-8℃
DNA酶反应液
6ml
12ml
2-8℃
线粒体裂解液
10ml
20ml
常温放置,如有沉淀可37℃水浴
蛋白沉淀液
7.5ml
15ml
2-8℃
核酸助沉剂
0.5ml
1ml
2-8℃
TE缓冲液
25ml
50ml
2-8℃
二,保存条件
本试剂盒整体保存于2-8℃一年,DNASE I、RNase A和 蜗牛酶  -20℃保存。使用前,在DNASE I中加入600ul(50T)或者1100ul(100T)的DNA酶反应液,分装后-20℃保存三个月,如果超过三个月,活性可能会降低,请自行订购DNASE I。线粒体裂解液使用前常温保存,如有沉淀可37℃水浴溶解,不影响使用。
三,说明
线粒体DNA提取的关键是尽可能的去掉核DNA。本试剂盒利用差速离心得到比较纯净的线粒体,再利用DNA酶消化和裂解缓冲系统等多步骤去掉核DNA,最后得到纯净的线粒体DNA。可用于PCR等对纯度要求较高的实验。
本试剂盒用于从酵母中分离出完整而纯化的线粒体DNA。
四,操作步骤
准备工作:在DNASE I中加入600ul(50T)或者1100ul(100T)的DNA酶反应液,适当分装后-20℃保存。线粒体裂解液保存于常温,如有沉淀37℃水浴溶解,离心机温度下降到4℃(2-8℃),如无低温离心机,也可以常温离心,并将离心时间减半,但最后所得DNA品质及产量可能会有一定影响。
 
1.取新鲜培养的1-5ml酵母培养物(约5×107细胞,湿重50mg或者50ul体积)离心后的收集物(4℃,1000× g 离心5 min)。双蒸水洗一到两次。离心,尽量弃上清。取50ul山梨醇缓冲液洗一次,离心,弃上清。
2.酵母沉淀用0.5ml山梨醇缓冲液重悬,加入10mg蜗牛酶,再加入5ul β-巯基乙醇,混匀(如果一次提取样本较多,可取0.5ml山梨醇缓冲液重悬,加入10mg蜗牛酶,再加入5ul β-巯基乙醇预混匀,混匀后每管样本加入0.5ml重悬酵母),30℃水浴1-2小时。4℃,1000× g 离心5 min,弃上清,得到原生质体。将得到的原生质体用0.5 ml原生质体裂解液重悬,再次离心,弃上清,得到原生质体。
3.将得到的原生质体用0.5 ml原生质体裂解液重悬,并转移到小容量玻璃匀浆器内,0℃冰浴研磨10~20次;
4.将研磨物放置合适的离心管,4℃,1000× g 离心5 min;
5.取上清,加入一新的离心管中,4℃, 16,000 × g 离心10 min。离心后的上清含胞浆成分,可从中提取胞浆蛋白。将上清转移到新离心管,线粒体沉淀在管底。
6. 在线粒体沉淀中加入0.5 mL 线粒体清洗液重悬线粒体沉淀,4℃,1000× g 离心5 min;取上清,加入一新的离心管中,4℃, 16,000 × g 离心10 min。弃上清,高纯度的线粒体沉淀在管底;
7. 加入100ul DNA酶反应液重悬线粒体,吹打均匀后,再加入10ul DNASE I溶液(见准备工作),混匀,37℃水浴10min。此步为消化线粒体表面吸付的核DNA。4℃, 16,000 × g 离心5 min。尽可能的弃上清,再加入200ul TE 重悬线粒体沉淀,4℃, 16,000 × g 离心5 min,洗去残留的DNA酶。
8.得到的沉淀,用200ul TE缓冲液重悬线粒体沉淀,加入10ul  RNase A。加入200ul线粒体裂解液,轻轻混匀(不可吹打),放置1-2min,再加入150ul蛋白沉淀液,迅速混匀。4℃, 16,000 × g 离心5 min。此步骤可进一步去除核DNA。
9.取上清,加入一新的离心管中(如用于酶切分析,可加入此步:选用等体积的酚氯仿异戊醇25:24:1抽提一次,再用氯仿抽提一次,或者直接用氯仿抽提两次,一般来说,此步可去掉一些微量蛋白及糖类,但会造成线粒体DNA的损失,因而用于PCR时可省,并不影响后续实验),加入0.6倍体积的异丙醇(如无异丙醇,可加入2.5倍体积的乙醇沉淀DNA,如离心管太满可分两管)及5-10ul 核酸核酸助沉剂,混匀,-20℃沉淀半小时左右(此步可省),4℃, 16,000 × g 离心10 min。
10. 弃上清,再加入1ml  70%乙醇清洗,4℃, 16,000 × g离心5min。重复用70%乙醇洗一次。
11. 弃上清,再次离心1min 吸弃上清,不要碰到管底,开盖凉干约5-10min。
12.加入20-30ul TE缓冲液,轻弹管底,37℃水浴5分钟,线粒体DNA溶解。
13. 进行DNA电泳检测及-20℃保存,进行下步的实验。
四 注意事项:
1. 为保证获得完整及尽可能多的线粒体,匀浆条件要示:第一是全程低温操作。第二是快速。第三,如有条件可将匀浆后的碎片在显微镜下观察。
2.如进行Western Blot和2D-胶电泳,可直接在第6步的沉淀中加入上样缓冲液裂解线粒体。
3.线粒体DNA本身含量很低,如果电泳检测不到,可加大上样量,用更少量的TE溶解沉淀,或者直接进入PCR检测。
4. 以离心力g计算正确的离心速度,不同的离心机可据此精确计算离心速度。

 
一般低温度心机都有离心力显示,如果没有,可以用以下公式简单的换算。
转速与离心力换算
G1.11×(10-5)×R×[rpm]
G为离心力,一般以g(重力加速度)的倍数来表示;
 [rpm] 即:转速的平方; R为半径,单位为厘米。
 
 
点击数:650  修改时间:2019-1-3 【打印此页】 【关闭
 
百浩天生物科技有限公司Copyright 2010-2017.
电话:027-89352536,15308622976。
E-mail:bio@biohao.com
公司地址:湖北省武汉市新洲区邾城街道黄茂里170号