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一，试剂盒组份
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组份 |
P0060 (20T) |
P0060 (50T) |
P0060 (100T) |
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5×Lysis Buffer |
20 mL |
50 mL |
100 mL |
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2.5M CaCl2 |
6mL |
15mL |
30mL |
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Store Buffer |
6mL |
15 mL |
30mL |
二，说明
本试剂盒可用于从动物组织中分离出内质网。提取内质网一般有密度梯度离心、氯化钙沉淀和超速离心等方法，本试剂盒采用氯化钙沉淀法提取。此方法操作简单，对离心机要求不高，所得内质网纯度一般。因为内质网含量少，提取困难，要求样本量大，一般不适用于从培养细胞中提取。
三，操作步骤
准备工作：将5×Lysis Buffer用双蒸水稀释成1×Lysis Buffer（1体积5×Lysis Buffer加入4体积的水混匀，稀释后可保存一个月），根据用量，将2.5M CaCl2稀释成8mM CaCl2(取320ul浓缩液稀释成100ml，现配现用，保存不超过48小时)，将稀释好的1×Lysis Buffer和8mM CaCl2 2-8℃存放。准备冷的PBS或者生理盐水。
1. 样本处理及匀浆：称取1g左右新鲜组织如肝脏、心肌等，切成不超过3mm厚片以方便清洗，用冷的PBS或生理盐水冲洗，洗净血水，滤纸吸干，用剪刀剪为碎块，放入玻璃匀浆器内，再加入1 mL冰预冷的1×Lysis Buffer，冰上研磨组织40次左右，到看不见明显碎块，也可用组织研磨仪处理样本(可一次性将5ml 1×Lysis Buffer都加入)，但处理条件请自行摸索，原则是尽量多破细胞膜而少破亚细胞膜，在其中找到平衡。
2. 将匀浆物转移到合适的离心管，再加入4ml预冷的1×Lysis Buffer，混匀。如果用研磨仪处理，可一次性将5ml 1×Lysis Buffer都加入。
3. 4℃，1000× g离心5 min，沉淀中主要为细胞和细胞核。
4．取上清（如果最上层有少量脂肪，可小心吸取脂肪丢弃，再取上清），加入一新的离心管中，4℃， 12,000 × g 离心10 min。沉淀有线粒体，可从中提线粒体蛋白。
5.将上清测体积并转移到合适的烧杯中，边搅拌边慢慢加入8体积的预冷的8mM CaCl2，加完后再次4℃搅拌15 min。
6. 将上步的混合物分装入合适的离收管中，4℃，8000× g 离心10 min。
7．弃上清，内质网在沉淀中。
8. 用100-300μL Store Buffer 或合适的缓冲液重悬内质网沉淀，立即使用或-70℃保存。
附：如果实验室有条件，可以从第4步结束后的上清，采用100 000× g（十万G） 4℃离心60 min也可得到内质网沉淀，两种方法得到的内质网组分并不完全相同。
四 注意事项：
1. 为保证获得完整的内质网，第一是全程低温操作。第二是快速。第三，在不破坏亚细胞器的情况下破碎细胞是制备内质网的比较关键环节。
2. 本试剂盒可以等比减少样本和试剂用量，比如一次用100mg样本，各试剂只用到十分之一，但结果可能是内质网提得的量特别少，以至后期实验无法展开。
3. 进行Western Blot和2D-胶电泳，可直接加入上样缓冲液裂解内质网。
五 储存：本试剂盒可4℃储存一年。 |
