SABC双标试剂盒说明书

 试剂盒组成:

1，  封闭液：10ml，5%BSA

2，  生物素化二抗：浓缩液100ul。

3，  SABC-FITC:浓缩液100ul。

4，  SABC-POD:浓缩液100ul。

5，  稀释液：30ml。

6，  显色液:20×DAB显色液A,20×DAB显色液B

7，  抗荧光衰减封片剂

试剂盒简介：

本试剂盒适合于一抗为小鼠/兔IgG/山羊的免疫组化实验. DAB及FITC显色。

SABC是专为免疫组化和其他免疫检测而设计的，用以显示组织和细胞中抗原分布。链霉亲和素(StreptAvidin)是一种从链霉菌中提取的蛋白质，同亲和素一样，对生物素有极高的亲和力，亲和素是一个碱性蛋白质（IP=10），经改造后可以转变成中性蛋白质。链霉亲和素等电点接近中性，对组织和细胞的非特异吸附很低，基于链霉亲和素的免疫组化方法背景很低。SABC即StreptAvidin—Biotin Complex。SABC大约可形成一百个左右的过氧化物酶和五十个左右的链霉亲和素所构成的复合物。大量的酶将保证SABC具有很高的敏感性。

自备试剂：

1．粘片剂多聚赖氨酸。

2． 0.01 M PBS（pH7.2-7.4）

3． 0.01M柠檬酸钠缓冲液

4、抗荧光衰减封片剂

 实验步骤:

以石蜡切片热修复为例

1. 切片常规脱蜡至水。3%H2O2室温5-10分钟以灭活内源性酶（如果FITC，刚可省掉此步）。蒸馏水洗3次。

2．热修复抗原:将切片浸入0.01M 枸橼酸盐缓冲液（PH6.0）,电炉或微波炉加热至沸腾后断电，间隔5-10分钟后，反复1-2次。冷却后PBS（pH7.2-7.6）洗涤1-2次。

3．滴加5%BSA封闭液,室温20分钟。甩去多余液体, 不洗。

4．用稀释液将一抗（如兔抗IL-10）按一定比例稀释（稀释后的一抗4℃可保存一周），也可另行购买抗体稀释液。滴加稀释的一抗，37 ℃ 1小时左右或20℃时2小时左右。也可4℃过夜。PBS（pH7.2-7.4）洗2分钟×3次。（一抗的稀释度、孵育时间和温度与染色强度、背景有直接关系。一般来说，阳性染色强度不够时，可提高一抗浓度和延长孵育时间；背景过高时，可降低一抗浓度和缩短孵育时间。）

5．根据使用量,用稀释液将生物素化二抗浓缩液按1:100稀释成工作液(1ml稀释液加入10ul生物素化羊抗兔IgG浓缩液,混匀即成工作液。此工作液4℃可保存一周).滴加生物素化羊抗兔IgG工作液,20-37℃ 30分钟。PBS（pH7.2-7.4）洗2分钟×3次。

如果想用荧光观察，请接下面步骤，如果想用DAB显色，请跳过6-7。

6．根据使用量,用稀释液将SABC-FITC浓缩液按1:100稀释成工作液(1ml稀释液加入10ul SABC-FITC浓缩液，混匀即成SABC-FITC工作液。此工作液4℃可保存一周).滴加SABC-FITC工作液,20-37℃，30分钟(避光)。PBS（pH7.2-7.4）洗5分钟×4次。

7．滴加抗荧光衰减封片剂封片。荧光显微镜观察。

如果想用DAB显色，请接8。

8．根据使用量,用稀释液将SABC-POD浓缩液按1:100稀释成工作液(1ml稀释液加入10ul SABC-POD浓缩液，混匀即成SABC-POD工作液。此工作液4℃可保存一周).滴加SABC-POD工作液,20-37℃，30分钟。PBS（pH7.2-7.4）洗5分钟×4次。

9．DAB显色:根据用量，用PBS（pH7.2-7.4）配制，按1mlPBS加入50ul 20×DAB显色液A，加入50ul 20×DAB显色液B 。混匀后加至切片。室温显色, 镜下控制反应时间，一般在5-30分钟之间。蒸馏水洗涤终止反应。

10．苏木素轻度复染。脱水,透明,封片。显微镜观察。

对于细胞片，常规固定后，PBS漂洗两次，再用0.5%Txiton X-100室温20分钟，PBS漂洗两次，3%H2O2（如果FITC，刚可省掉此步）处理15分钟；PBS漂洗两次，下接上面第4步。

对于冰冻切片，固定后，可用PBS漂洗两次，再接上面第二步。

注意事项：如果染色背景过高，在SABC反应之后，DAB显色之前,用加有0.01—0.02% TWEEN-20的PBST（pH7.2-7.4）洗涤切片4次，PBS洗2次，然后DAB显色。

因为免疫组化指标众多，标本不一，此步骤仅作参考。

注意事项：如果染色背景过高，在SABC反应之后，用加有0.01—0.02% TWEEN-20的PBST（pH7.2-7.4）洗涤切片4次，PBS洗2次，然后封片观察。