线粒体提取试剂盒使用说明

 一，试剂盒组份

二，说明

线粒体提取试剂盒用于从动物细胞或组织中分离出完整而纯化的线粒体。适合于动物软组织（肝或脑组织）和硬组织（肌肉）以及培养细胞的线粒体的制备。其制备物产量高，可以被用于细胞凋亡、信号传递、代谢和蛋白组学等的研究。

三，操作步骤

1. 样本处理

a. 组织匀浆：称取100~200 mg新鲜组织如肝脏、脑、心肌等，PBS或生理盐水冲洗，洗净血水，滤纸吸干，用剪刀剪为碎块放入小容量玻璃匀浆器内。加入1.0 mL冰预冷的Lysis Buffer，0℃冰浴上下研磨组织20次；

b. 培养细胞匀浆：消化细胞，PBS洗涤，800 × g 5~10 min离心收集细胞。计数。每次提取需要5 × 10⁷个细胞，加入1.0 mL冰预冷的Lysis Buffer重悬细胞，将细胞悬液转移到小容量玻璃匀浆器内，0℃冰浴研磨30~40次；

2. 将组织或细胞匀浆物转移到离心管，4℃，1000× g 离心5 min；

3. 取上清，加入一新的离心管中，4℃，1000× g 再次离心5 min。

4．取上清，加入一新的离心管中，4℃， 12,000 × g 离心10 min。离心后的上清含胞浆成分，可从中提取胞浆蛋白。将上清转移到新离心管，线粒体沉淀在管底；

5. 在线粒体沉淀中加入0.5 mL  Wash Buffer重悬线粒体沉淀，4℃，1000× g 离心5 min；

6．取上清，加入一新的离心管中，4℃， 12,000 × g 离心10 min。弃上清，高纯度的线粒体沉淀在管底；

6. 用50 -100μL Store Buffer 或合适的反应缓冲液重悬线粒体沉淀，立即使用或-70℃保存。

四 注意事项：
1. 为保证获得完整的线粒体，第一是全程低温操作。第二是快速。第三，在不破坏亚细胞器的情况下破碎细胞是制备线粒体的最关键环节。与组织块相比，培养细胞特别是贴壁培养细胞在用玻璃匀浆器匀浆时较难破壁，因而要选用小容量玻璃匀浆器、间隙严密的研杵上下研磨培养细胞。
2. 以离心力g计算正确的离心速度，不同的离心机可据此精确计算离心速度。
3. 进行Western Blot和2D-胶电泳，可直接加入上样缓冲液裂解线粒体。

五 储存：四周内使用可4℃储存，长期置-20℃

转速与离心力换算

G＝1.11×(10^-5)×R×[rpm]^２
G为离心力，一般以ｇ（重力加速度）的倍数来表示；

 [rpm] ^２即：转速的平方； R为半径，单位为厘米。