谷胱甘肽GST琼脂糖凝胶FF

GST琼脂糖凝胶FF

一、简介

GST琼脂糖凝胶FF是专门设计用于纯化谷胱甘肽S-转移酶（GST）融合蛋白、谷胱甘肽转移酶以及与谷胱甘肽有亲和作用的蛋白的亲和填料，一步分离就可得到很纯的目标蛋白，纯化条件温和，可以保证蛋白的活性。

本产品有很好的物理和化学稳定性，可反复使用5-10次，使用方便。可小批量纯化或者大规模生产。是你理想的选择。

二、亲和填料特性：

特点	基团密度高，载量大
基质	6%的交联琼脂糖凝胶
吸附载量	5-10mgGST融合蛋白/ml
亲和填料的颗粒大小	45-165μm
最大流速	300cm/h
pH工作范围	3-10
pH清洗范围	2-11
使用温度	常温或者+2~8℃
保存温度	+2~8℃
保存液体	20%乙醇
化学稳定性	70%乙醇，6M盐酸胍

三、适用范围

分离谷胱甘肽S-转移酶（GST）融合蛋白、其它的谷胱甘肽转移酶以及与谷胱甘肽有亲和作用的蛋白。

四、实验步骤：

仪器纯化：

1、GST琼脂糖凝胶FF装柱，0.7×2.5cm，柱床体积为1ml；

2、用缓冲液A平衡5个床体积，流速为1ml/min；

3、将10ml发酵液用缓冲液A稀释到20ml，0.45μm滤膜过滤，上样。流速为1ml/min；

4、用缓冲液A再洗10个床体积，流速为1ml/min；

5、用缓冲B洗脱，流速为1ml/min，收集洗脱峰

6、0.5M的NaOH以1.5cm/min的速度淋洗柱子3-5柱床体积，然后用缓冲液A洗到中性即可重复使用。或者再用纯水洗5个柱床体积，再用20%的乙醇洗5个柱床体积，流速为1ml/min，柱子置于+2~8℃环境中保存。

手工纯化：

1、GST琼脂糖凝胶FF装柱，柱床体积为柱体积的4/5左右；

2、用缓冲液A平衡5个床体积，直接加在柱项，自然流下。

3、将含目标蛋白的溶解用0.45μm滤膜过滤，再平衡好的凝胶吹出来，泡在溶液中，+2~8℃环境2-4小时。

4、装柱，用缓冲液A再洗10个床体积，柱顶加入，自然流下。

5、用缓冲B洗脱，分段收集。

6、用0.5M的NaOH淋洗柱子3-5柱床体积，然后用缓冲液A洗5个床体积即可重复使用。如果一时不用，可以再用纯水洗5个柱床体积，再用20%的乙醇洗5个柱床体积，柱子置于+2~8℃环境中保存。

附：缓冲液配制：

缓冲液A：50 mM Tris-HCl缓冲液，pH8.3，配制：0.1M Tris溶液50ml，加0.1 M盐酸20ml，0.9gNaCl，加水至100ml。

缓冲液B：50 mM Tris-HCl缓冲液(含20mM还原型谷胱甘肽)，pH8.3，配制：0.1M Tris溶液50ml，0.614g还原型谷胱甘肽，然后用0.1 M盐酸调pH到8.3，加水至100ml。 (还原型谷胱甘肽容易氧化，所以这个缓冲液最好现配现用，别一次配太多，免得浪费)

五、应用的注意事项：

1、GST融合蛋白与还原型谷胱甘肽的结合比较缓慢，为了获得最大的结合量，很重要的一点就是保证足够作用时间，而流速是影响GST融合蛋白与色谱填料结合的关键因素之一，所以必须在上样时维持较低的流速。在样品中加5-10mM DTT这样可以增加填料对目标蛋白的吸附。对于过柱子还是吸附不好的样品，可以在这样情况下把填料和样品混合2-4小时，然后再装柱子操作。当然也可以用离心的方法做，这样不需要柱子，便于检测，具体的方法可以参考《分子克隆》。

2、对不同的GST融合蛋白，洗脱体积和洗脱时间会有所不同，可能会需要更高浓度的还原型谷胱甘肽。如果需要的话，需要对流穿液、洗脱液进行SDS-PAGE以及Western杂交分析。

3、GST融合蛋白的浓度也可以通过标准色谱法来确定。如果用Lowry 或者BCA分析，样品需, 要先利用, 脱盐柱进行缓冲液交换处理或者是透析处理。以除去其中的还原型谷胱甘肽，因为还原型谷胱甘肽的存在会干扰测定。

4、纯化过程中的杂带常见的原因有：破碎断裂或者酶解，所以破碎要温和，长时间处理样品及过柱子可以加酶抑制剂；样品纯化前要过滤，避免不溶解物质干扰；可以在平衡缓冲液和样品中加0.1%吐温降低非特异吸附。GST融合蛋白有时候只表达到GST部分就终止，出现26KD左右的杂带，可以尝试用不同浓度的还原谷胱甘肽洗脱，如果还是去初不了，那只能优化表达或重新构建。

5、GST琼脂糖凝胶能否重复利用要根据样品来定，而且只能用来处理同一种样品，以防止交叉污染。别的同类产品的说明书可以互相参考。

GST融合蛋白用凝血酶、肠激酶和Xa因子裂解，再用离子交换色谱把GST和目标蛋白分离。一般凝血酶用量为10U/mg，裂解条件是22-25℃，2-16小时。此外还可以亲和色谱把GST和凝血酶去除，而得到纯的目标蛋白。

1、最简单的方法是用0.5M的NaOH以100cm/h的速度淋洗柱子3-5柱床体积，然后用缓冲液洗到中性即可重复使用。或者用20%乙醇洗到中性保存。

2、除去强的疏水性蛋白和脂质等，用4倍柱床体积的70%的乙醇或者30%的异丙醇洗柱子。然后保存在20%乙醇中。