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细胞消化
双击自动滚屏 发布者:百浩生物 发布时间:2011-4-9 阅读:12219

Hanks液是常见的平衡盐溶液(BSS)之一。D-Hanks液则是无钙镁离子的Hanks液。BSS与细胞生长状态下的pH值、渗透压及无菌状态一致,且配方简单,是组织培养基本用液,常用于配制培养基及其他用液,或洗细胞等,细胞在BSS中可生存几个小时。 胰蛋白酶溶液是一种常用的细胞消化液,原代培养时用于处理组织块,使细胞分离下来。传代时用胰蛋白酶使培养细胞离开所贴附的培养瓶表面,并分散成单个细胞。胰蛋白酶主要采自牛或猪的胰脏,呈白色粉末状,易潮解,应在低温干燥处保存。胰酶的活力常用一份胰酶解离酪蛋白的份数表示,常用胰酶活力为11251250

胰蛋白酶对细胞的分离效果与细胞的类型、特性和瓶壁表面特性有关。一般来说浓度大、温度高(勿高于37)、作用时间长,则对细胞分离能力大。但超过一定程度会损伤细胞,导致细胞传代后不能贴壁或死亡。胰酶在pH 8.037时消化能力最强。溶液中的Ca2+Mg2+和血清会降低胰酶活力,所以配制胰酶时须用无Ca2+Mg2+D-Hanks液。当消化结束时,可加入少量血清或含血清的培养基以终止胰酶作用。

细胞传代使用的胰酶浓度是0.25%0.2%。用于原代细胞培养消化组织块则为0.1%0.125%

材料:3000 mL锥形瓶,25 mL50 mL试剂瓶,500 mL输液瓶,螺口盖,翻帽塞,pH试纸,孔径0.22μm的微孔滤膜。

药品:NaClNa2HPO4KH2PO4KCl,酚红,NaHCO3,胰蛋白酶干粉,0.02%EDTACaCl2D-葡萄糖,MgCh·6H20MgSO4·7H2O,酚红(0.1%)(配法:称酚红2 g,置于研磨器中,先用数滴5.6%NaHCO3溶液溶解并研磨,再加进该5.6%NaHCO3溶液使最终体积为100 mL。瓶装保存,备用)

仪器: 抽滤泵1套,过滤器1套,高压灭菌锅,量筒,磁力搅拌器,研磨器。

()配制D-Hanks

1.按下表称取D-Hanks试剂。

2.依次加入上述试剂至800 mL无菌水中,磁力搅拌下溶解,加2%酚红1ml(如果是储存以后用,则先不加),定容至1000 mL

3.高压灭菌,1010 min

NaCl 8.00g

KCl 0.40g

Na2HPO4•12H2O 0.12g

或者Na2HPO47H2O 0.09g

或者Na2HPO4H2O 0.06g

或者Na2HPO4 0.048g

KH2PO4 0.06g

无水葡萄糖 1.00g

双蒸水 1000ml

()配制Hanks

详见Hanks液、PBS的配制

 ()配制胰蛋白酶消化液

1D-Hanks液高压灭菌之后,晾至室温,4保存备用。

2.称取一定量胰蛋白酶粉末于研磨器中(夏天时研磨器应放在冰浴中),加入少量D-Hanks液研磨1 000次左右,调制成糊状。再放入4预冷的适量D-Hanks液中,4下磁力搅拌使完全溶解。

3.用NaHCO3干粉将胰酶溶液的pH值调至8.0左右(胰酶作用的最适pH),并加入0.02%EDTA以协助消化作用。

4.滤过除菌,-20冻存。

注意事项:

1BSSpH值应确定为7.2左右。

2.如配制的Hanks液高压灭菌后液体变混,则可将100 mLCaCl2与含有其他成分的液体分别装瓶高压灭菌之后,再在无菌条件下配制,定容。这样可以避免高压灭菌后液体变混。

3.胰酶受热易失活,所以尽量避免盛夏配制,并且在配制过程中温度应始终保持在4左右。

4.胰酶研磨要充分,否则在过滤时会将较大的颗粒过滤掉,不能达到真正的浓度。

5.胰酶分装时尽量分装成多瓶,并遵守3次左右用完和只装2/3体积的原则。因为冷冻保存时体积会膨胀,而多次使用同一瓶胰酶反复冻融会降低消化效果并可能造成污染。

 

补充:EDTA-胰蛋白酶的配制

1、胰酶是0.25%,这是质量体积比,就是说0.25g胰酶溶于100ml PBS,注意,尽量不要用水来溶,因为要保持渗透压。

2EDTA的工作液溶度是0.02%-0.1%,根据细胞消化的难易程度自己调整。EDTA并不是必须的,容易消化的细胞可不加。EDTA对细胞贴壁性有影响,因此使用时要甚重。如果影响贴壁,但消化时必须要用,那么在用完全培养基终止消化后,可离心弃上清,再加完全培养基培养,可去除EDTA。如果对贴壁没影响,那么可不离心。

3EDTA的浓度也是质量体积比。和胰酶一起溶于PBS

4、注意,血清可终止胰酶的作用,但不能终止EDTA的作用,对有些细胞来说,终止消化后的离心是必要的。

5、胰酶和EDTApH 8左右的时候最易溶解,在配制时可先滴几滴NaOHpH调至8,注意,胰酶可使溶液变酸,所以要边溶边测pH,随时调整。注意,不可加过量NaOH,否则过碱,细胞会受不了。

6、胰酶EDTA相对比较难溶,可用磁力搅拌器,或放入4度冰箱过夜,待溶解后过滤除菌。

7、可配2-3×的胰酶,这样比较节约时间和滤器,用的时候对上灭菌PBS即可。

8、储存液放在-20度冰箱冻存,使用液放在4度,用的时候不要放在27度水浴锅温浴,因为这样会让胰酶很快失效,使用前放在室温下一会,因为加的量很少,所以一般不会冻坏细胞。

9、消化时,向培养瓶中加入适量胰酶,个人经验,一般10cm培养皿加入0.5ml足已,加入后,立刻摇晃培养皿,使胰酶铺满,一旦铺满,立刻用负压吸引器吸去多余的胰酶,再放入37度培养箱消化。

10、注意,过量的胰酶对细胞是有害的,而EDTA过多也会影响贴壁,所以没必要把细胞泡在胰酶里面消化。

11、胰酶37消化效果最好,低于37度也有消化能力,有些容易消化的细胞在消化时甚至不需要放入培养箱。注意,不可消化过久。

 
 

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